Raffaella Buzzetti, Marialuisa Spoletini, Claudio Tiberti
Dipartimento di Medicina Sperimentale “Sapienza” Università di Roma
UOC di Diabetologia Universitaria, Polo Pontino, “Sapienza Università di Roma”
Premessa e background
Diabete tipo 1
Il diabete tipo 1 (T1D) è una malattia autoimmune a suscettibilità poligenica determinata dalla distruzione delle beta-cellule pancreatiche (1). Gli autoanticorpi (Fig. 1) non sembrano avere un ruolo patogenetico diretto, tuttavia, la loro presenza, quale possibile conseguenza della processazione di antigeni insulari, li rende marcatori preziosi di malattia. È stato dimostrato che almeno un autoanticorpo è presente nel siero del 95-98% dei pazienti alla diagnosi del T1D (2). Tra essi i più importanti sono gli autoanticorpi anti-insula pancreatica (ICA) (3), anti-decarbossilasi dell’acido glutammico (GAD) (4), anti-insulina (IAA) (5), anti-tirosina fosfatasi (IA-2A) (6), anti-trasportatore dello zinco 8 (ZnT8) (2). Il T1D si può manifestare a qualsiasi età ma presenta un picco di incidenza intorno ai 7 anni, un secondo picco intorno ai 14 anni (7) ed incirca la metà dei pazienti esordisce prima dei 25 anni di età (8). Inoltre, numerosi studi hanno riscontrato che il rischio di sviluppare il T1D aumenta significativamente in presenza di specifici aplotipi HLA di classe II quali DRB1*03-DQA1*0501-DQB1*0201 e DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*0302 (9-11).
La determinazione degli ICA ha rappresentato il “gold standard” per la valutazione degli anticorpi anti-insula fino all’inizio degli anni Novanta. Attualmente il loro dosaggio non viene quasi più effettuato, in parte per la difficoltà di standardizzare la metodologia in immunofluorescenza con cui vengono determinati, ma soprattutto per la difficile reperibilità del pancreas umano necessario alla loro esecuzione.L’insulina è stato il primo autoantigene insulare caratterizzato a livello molecolare. La frequenza degli autoanticorpi IAA in pazienti diabetici è influenzata dall’età di insorgenza, risultando elevata nei bambini e bassa negli adulti (12). La clonazione della decarbossilasi dell’acido glutammico, GAD), enzima catalizzatore della sintesi di acido gamma-aminobutirrico (GABA) ha permesso lo sviluppo di numerosi dosaggi per la determinazione degli autoanticorpi GAD nel siero umano, che ad oggi rappresentano il marcatore più frequente di autoimmunità nel diabete, presente in percentuali rilevanti in ogni fascia di età. La tirosina fosfatasi 2, IA-2, è una glicoproteina transmembrana localizzata nei granuli secretori delle cellule endocrine che appare coinvolta nel processo di secrezione insulinica (13). È stato dimostrato, mediante dosaggi radioimmunologici, che gli autoanticorpi IA-2 sono altamente specifici per il T1D e diretti verso epitopi diversi a seconda dell’età di insorgenza (14).
Recentemente nel siero dei pazienti con T1D è stato identificato un altro autoanticorpo, diretto verso una proteina di membrana, trasportatrice dello zinco lo ZnT8 (2) che si trova nei granuli secretori da cui viene rilasciata l’insulina (2).
Latent Autoimmune Diabetes in the Adult (LADA)/Non Insulin Requiring Autoimmune Diabetes (NIRAD)
Nel 1977 Irvine et al. hanno rilevato la presenza di ICA in alcuni pazienti con diagnosi di diabete di tipo 2 (T2D) (15). Per definire questo sottotipo di diabete mellito caratterizzato da non necessità di trattamento insulinico al momento della diagnosi clinica e dalla presenza di autoanticorpi caratteristici del T1D, sono state utilizzate varie denominazioni tra cui Non Insulin Requiring Autoimmune Diabetes (NIRAD) ecc. La denominazione che ha avuto il maggiore consenso nella letteratura scientifica per questa forma di diabete è LADA definito come una forma di diabete che non richiede terapia insulinica per almeno 6 mesi dalla diagnosi clinica, ed è caratterizzata dalla presenza di autoanticorpi diretti verso la GAD (8), IA-2, e più raramente ZnT8 ed insulina.
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Studi osservazionali
T1D
Numerosi studi hanno riportato che nel 50-70% di bambini con T1D è possibile rilevare la presenza degli autoanticorpi anti-insulina (IAA) (16). Tuttavia, gli IAA possono essere determinati solo in sieri prelevati alla diagnosi della malattia (16), perché successivamente sono difficili da distinguere dagli anticorpi anti-insulina che si formano in seguito alla somministrazione di insulina esogena. Nei pazienti con T1D di recente insorgenza è possibile rilevare la presenza di autoanticorpi GAD nel 70-75% dei casi (17). A differenza di altri, la frequenza degli autoanticorpi GAD in pazienti con T1D di recente diagnosi non è influenzata dall’età e questi autoanticorpi rappresentano il marcatore immunologico a più alta sensibilità diagnostica in pazienti con esordio clinico in età adulta (18). La simultanea presenza di GAD e di altri autoanticorpi anti-insulari si associa ad un alto rischio di T1D (19). Gli autoanticorpi IA-2 sono presenti nel siero del 70-80% dei bambini neo diagnosticati. Analogamente agli IAA, anche gli IA-2 sono meno frequenti in pazienti con esordio di T1D in età adulta (20). Gli anticorpi ZnT8 sono stati rilevati nel 60-80% di pazienti T1D neo-diagnosticati ed in meno del 2% di soggetti sani di controllo e nel 26% di soggetti diabetici classificati come negativi per gli altri autoanticorpi diabete-specifici (2). Studi su ampie casistiche, effettuati in pazienti diabetici e in soggetti di controllo sono attualmente in corso per valutare la sensibilità e la specificità diagnostica di questo marcatore al fine di determinare la sua potenziale applicabilità alla routine clinica. È tuttavia già noto che la determinazione degli autoanticorpi ZnT8 incrementa al 95-98% la percentuale di T1D identificati positivi per autoimmunità umorale diabete-specifica alla diagnosi, rispetto al 90-94% dei pazienti individuati positivi quando vengono dosati soltanto autoanticorpi GAD, IA-2 ed anti-insulina.
LADA/NIRAD
Nel corso degli ultimi anni molti studi hanno valutato la frequenza degli autoanticorpi GAD in pazienti con una diagnosi clinica di diabete di T2D. La maggior parte degli studi ha dimostrato che questi anticorpi erano presenti nel 9-12% di pazienti diabetici inizialmente diagnosticati come T2D (21-30) e comunque la frequenza del LADA nei diversi studi su pazienti con T2D variava da un minimo di 2-5% (31-34) ad un massimo del 20% (35). Il progetto NIRAD, finanziato dalla Fondazione Diabete e Ricerca della Società Italiana di Diabetologia ha messo in evidenza che la frequenza degli autoanticorpi nel LADA/NIRAD è del 4.5% per i GAD (31), dell’1.4% per gli anti-ZnT8 (36) e dello 0.91% o del 3.5% per gli autoanticorpi anti-IA-2, a seconda che tali autoanticorpi siano diretti verso la porzione c-terminale o centrale della proteina (31, 37-38). Alcuni studi hanno osservato un’associazione tra positività per autoanticorpi GAD ed un aumento del rischio di sviluppare insulino dipendenza entro pochi anni (37-40). In particolare hanno dimostrato che in presenza di un elevato titolo anticorpale GAD, entro 7 anni, un numero significativamente più elevato di pazienti LADA, richiedeva la terapia insulinica rispetto a pazienti con T2DM o con basso titolo GAD (40).
Gli autoanticorpi IA-2 diretti verso la porzione C-terminale della proteina sono stati riscontrato nell’1.4% dei T2D nel Perugia Study (30) e nello 0.91% di T2D reclutati dal Progetto multicentrico NIRAD (31). Lampasona V et al. hanno osservato che gli anticorpi ZnT8 erano presenti nel 18.6% di pazienti LADA e nell’1.4% di T2D (36). Lo studio inoltre ha dimostrato che la frequenza degli autoanticorpi ZnT8 era più elevata nei pazienti LADA con un’età <50 anni rispetto a quella riscontrata nei pazienti con età ≥50 anni (12.2% vs 6.6%) (36).
Dosaggio autoanticorpale
Attualmente sono disponibili molti metodi per la valutazione degli autoanticorpi antigene-specifici nel diabete autoimmune, utili per la predizione e la diagnosi del T1D e del LADA. Per confrontare l’accuratezza diagnostica delle diverse metodiche necessarie alla determinazione di autoanticorpi antigene-specifici quali gli IAA, i GAD, ed gli IA-2, sono stati effettuati numerosi workshops di standardizzazione, basati sull’uso di sieri di soggetti T1D alla diagnosi e di soggetti sani. Il primo Combinatorial Autoantibody Workshop, ha riportato i dati ottenuti da alcuni laboratori sulle determinazioni autoanticorpi anti-GAD, anti-IA-2 ed IAA con metodiche radioimmunologiche (RIA) o immunoenzimatiche (ELISA). Dal Workshop è emerso che, per quanto riguarda le determinazioni degli anticorpi anti-GAD ed anti-IA-2, solo metodiche RIA basate sulla immunoprecipitazione di autoantigeni prodotti tramite trascrizione e traduzione in vitro della proteina bersaglio si sono dimostrate sufficientemente accurate in termini di sensibilità e specificità diagnostica. Per quanto riguarda gli IAA, spesso le sensibilità diagnostiche delle metodiche utilizzate nei vari laboratori si sono rivelate molto diverse. A tale proposito è utile sottolineare che gli autoanticorpi anti-insulina vengono normalmente dosati solo con metodiche RIA, in quanto i metodi immunoenzimatici via via descritti nel tempo, si sono rivelati quasi sempre inadatti al individuare questo genere di autoimmunità umorale. Successivamente, i dati pubblicati dal primo Diabetes Autoantibody Standardization Program (DASP), hanno confermato la maggiore affidabilità delle metodiche RIA verso le metodiche ELISA per la determinazione dei GAD e degli anti-IA-2, così come una scarsa concordanza dei risultati delle determinazioni IAA in diversi laboratori. Solo recentemente, nell’ambito di uno degli ultimi studi DASP, sono stati evidenziati i risultati prodotti da kit ELISA commerciale per la determinazione degli autoanticorpi GAD e da un dosaggio combinato IA-2/GAD che sembrano poter individuare l’autoimmunità umorale diabete-specifica con elevati livelli di sensibilità e specificità diagnostiche. Questi risultati saranno utili per una maggiore diffusione di metodiche non radioimmunologiche nella routine clinica dei laboratori.
Tuttavia, attualmente la sensibilità e la specificità delle metodiche ELISA commerciali sono molto variabili e spesso al di sotto delle metodiche RIA. È comunque importante che prima di utilizzare metodiche RIA od ELISA nell’ambito di determinazioni autoanticorpali diabete-specifiche, ci si assicuri che esse siano state validate per la loro accuratezza, sensibilità e specificità diagnostica nell’ambito di programmi internazionali di standardizzazione quali il DASP (o lo IASP, che ha recentemente sostituito i programmi DASP).
Razionale
La velocità di distruzione beta-cellulare nel T1D è variabile, essendo rapida soprattutto in bambini ed adolescenti e più lenta negli adulti. Tale velocità di perdita di massa beta-cellulare e quindi di secrezione insulinica condiziona l’esordio clinico e la sintomatologia caratterizzata da poliuria, polidipsia, dimagrimento fino alla chetoacidosi (41-42).
Nei bambini/adolescenti con T1D, nella maggior parte dei casi, la presenza di iperglicemia associata a segni clinici di insulino-deficienza non pone dubbi diagnostici e comunque l’eventuale assenza di tali evidenze in un bambino/adolescente con diagnosi clinica di T1D non modifica il tipo di terapia (43). In una minoranza di casi, rari in età infantile, ma più frequenti nella fascia di età tra 15 ed i 30 anni e nell’adulto, l’esordio clinico del T1D può avvenire, tuttavia, in assenza del caratteristico quadro sintomatologico (44). In tali casi solo la determinazione degli autoanticorpi permette di differenziare il T1D dal T2D. Il dosaggio degli autoanticorpi riveste inoltre un importante significato per la predizione del T1D nei soggetti geneticamente a rischio di malattia quali ad esempio i familiari di primo grado dei T1D. Per i soggetti LADA/NIRAD la determinazione anticorpale ha un ruolo fondamentale in quanto la positività ad almeno un autoanticorpo, per lo più GAD, rappresenta il principale criterio diagnostico. Per la corretta diagnosi del LADA è dunque necessario valutare la presenza di autoanticorpi diabete-specifici, in particolare gli autoanticorpi GAD. La sensibilità diagnostica degli altri marcatori nell’adulto è piuttosto bassa e per questo sarebbe necessario definire con criteri appropriati la popolazione da sottoporre ad analisi anticorpale.
Conclusioni e raccomandazioni
Per quanto riguarda il dosaggio degli anticorpi GAD sono a disposizione kits, in commercio, gran parte dei quali è in linea con gli standard necessari di sensibilità e specificità metodologici per tale tipo di analisi. Per il dosaggio degli autoanticorpi anti-insulina è facile reperire kits in commercio, ma spesso le performances di tali kits non sono adeguate, e spesso non validate mediante opportune standardizzazioni (DASP/IASP). Per tale dosaggio è importante, almeno per ora, basarsi ancora sull’uso di metodologie radioimmunologiche, che non a caso sono le più utilizzate nei migliori laboratori di ricerca internazionali. È però necessario considerare che questi laboratori spesso mettono a punto tali metodiche “in casa” e pertanto esse non sono reperibili commercialmente. Per quanto concerne gli autoanticorpi IA-2 e ZnT8, che sicuramente possono essere un utile complemento alla determinazione degli autoanticorpi GAD and anti-insulina, l’elevato costo dei relativi kits ne consiglia l’utilizzo solo in studi molto mirati e non a scopo diagnostico nella routine clinica giornaliera.
Dagli studi e dalle precedenti considerazioni emergono pertanto le seguenti indicazioni per il dosaggio degli autoanticorpi a fini diagnostici nel T1D:
1.il dosaggio degli autoanticorpi IAA è da effettuare limitatamente alla fascia di età infantile/adolescenziale e dopo aver iniziato la terapia insulinica da non più di 10-15 giorni, in quei casi in cui sia necessario porre una diagnosi differenziale con diabete neonatale, MODY, forme di diabete genetico, e ove non sia evidente da un punto di vista clinico la diagnosi di T1D.
2.Il dosaggio degli autoanticorpi GAD rappresenta un importante ausilio diagnostico in età infantile/adolescenziale ove non sia evidente da un punto di vista clinico la diagnosi di T1D. Tale determinazione è,inoltre, da effettuare in pazienti di qualsiasi età in cui non vi sia una chiara diagnosi clinica di T1D e nasca, pertanto, l’esigenza di porre una corretta diagnosi differenziale. Nei pazienti con esordio in età <30 anni per differenziare da MODY o diabete tipo 2 ad insorgenza precoce. Nei pazienti >30 anni per diagnosi differenziale con diabete tipo 2.
3.Il dosaggio degli autoanticorpi IA-2 e-ZnT8 può essere un utile complemento alla determinazione della positività autoanticorpale, ma solo in casi particolari non essendo attualmente in essere alcuna indicazione per il loro utilizzo a scopo diagnostico nella routine clinica giornaliera.
Nel LADA:
– la positività per autoanticorpi diabete-specifici rappresenta un criterio diagnostico imprescindibile per questa forma di diabete, pertanto si consiglia il dosaggio (almeno degli autoanticorpi GAD) nei pazienti con diagnosi di T2D ad esordio precoce (<50 anni), con T2D associato a malattie autoimmuni organo specifiche, in pazienti con scarso controllo metabolico alla terapia orale (HbA1c >7.5) in presenza di un fenotipo clinico non caratteristico di T2D (BMI<25, assenza di dislipidemia ecc.).
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